Optimierung der Zelllebensfähigkeit in Tröpfchen

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 11304 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Bei der Biofabrikation werden üblicherweise Flüssigkeitströpfchen verwendet, um Zellen zur gedruckten Struktur zu transportieren. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aufprall ist jedoch nur unzureichend kontrolliert und erforscht, was Anwendungen wie das Besprühen von Zellen, das Inkjet-Bioprinting und den lasergestützten Zelltransfer erschwert. Hier präsentieren wir ein analytisches Modell, das die Lebensfähigkeit der Zelle nach dem Aufprall als Funktion der Eigenschaften des die Zelle umgebenden Tröpfchens beschreibt. Das Modell verbindet (1) das Zellüberleben als Funktion der Zellmembrandehnung, (2) die Membrandehnung als Funktion der zellhaltigen Tröpfchengröße und -geschwindigkeit und (3) die Substrateigenschaften. Das Modell wird durch Messungen der Zelllebensfähigkeit beim Zellsprühen validiert, einem Verfahren zur Biofabrikation, das zur Behandlung von Brandwunden eingesetzt wird. Die Ergebnisse ermöglichen eine rationale Optimierung jeder tröpfchenbasierten Zellabscheidungstechnologie und wir enthalten praktische Vorschläge zur Verbesserung der Zelllebensfähigkeit beim Zellsprühen.

Die tropfenbasierte Zellablagerung erhält zunehmend Aufmerksamkeit als Werkzeug zum Aufbau oder Füllen einer Vielzahl biologischer Gewebe. Markante Beispiele sind die Zellspray-Behandlung von Verbrennungen1,2 oder Geschwüren3, die eine schnellere und verbesserte Heilung ermöglichen und derzeit in der klinischen Praxis eingeführt werden. Mit einer erfolgreichen Anwendung streben wir eine Ausweitung auf andere klinische Bereiche an, darunter laparoskopische, endoskopische und arthroskopische Verfahren4. Dies eröffnet die Möglichkeit einer minimalinvasiven Zelltherapie zur Geweberegeneration. Ein zweites Beispiel ist die Herstellung von funktionellem Gewebeersatz im Labor, um die Heilung von nicht funktionellem Gewebe zu ermöglichen5,6,7. Bei aktuellen Biofabrikationstechnologien, einschließlich Tintenstrahl-Bioprinting8,9,10, laserinduziertem Vorwärtstransfer11, ventilbasiertem Bioprinting12,13 und Zellsprühen2,14,15,16,17, erfolgt der Zelltransport aus der anfänglichen Zellsuspension, genannt „Bio -Tinte“ auf das hergestellte Gewebe wird durch Ausstoßen und Abscheiden von Flüssigkeitströpfchen erreicht. Obwohl diese Technologien die Ablagerung hochlebensfähiger Zellen ermöglichen, stellen ein begrenzter Durchsatz, eine begrenzte Präzision und schlecht optimierte zellhaltige Biotinten große Hindernisse bei der kontrollierten Ablagerung von Zellen dar, wie sie beispielsweise für die Herstellung funktioneller Gewebe erforderlich ist5,7.

Um diese Probleme zu lösen und dadurch die tröpfchenbasierte Zellablagerung zu optimieren, ist die Kenntnis der Zelllebensfähigkeit als Funktion der zellhaltigen Tröpfchengröße und der Aufprallgeschwindigkeit von entscheidender Bedeutung. Im Idealfall würden einzelne, hoch reproduzierbare Stöße von Tröpfchen, die eine einzelne Zelle enthalten, für einen großen Bereich der Aufprallparameter (Tröpfchengröße, Geschwindigkeit und Materialeigenschaften) überwacht. Drop-on-Demand-Systeme liefern solch hoch reproduzierbare Tröpfchen, aber normalerweise ist der Aufprallparameterraum für die verwendeten zellhaltigen Flüssigkeiten relativ eng18,19,20,21,22,23. Um die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aufprall zu untersuchen, verwenden wir daher die Zellsprühabscheidung, die einen viel größeren Bereich an Aufprallparametern ermöglicht. Der wesentliche Einfluss der Sprühparameter auf die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aufprall2,15,16,17,24 legt nahe, dass die Lebensfähigkeit der Zellen kontrolliert werden kann, was ein Modellsystem zur Bewertung des Zellüberlebens nach dem Aufprall darstellt. Darüber hinaus ist die auf die Zelle innerhalb der Sprühdüse ausgeübte Scherspannung viel geringer als die Scherspannung beim Aufprall, was eine alleinige Beurteilung des Aufprallprozesses ermöglicht (bei anderen Technologien ist dies nicht der Fall, wie im ergänzenden Abschnitt I erläutert).

Die aktuelle Arbeit zielt darauf ab, den Einfluss des Tröpfcheneinflusses auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu verstehen, was sowohl auf Drop-on-Demand- als auch auf Sprühabscheidungstechnologien anwendbar ist. Wir stellen ein Modell vor, das die Zelllebensfähigkeit als Funktion der zellhaltigen Tröpfchengröße, der Viskosität und der Aufprallgeschwindigkeit beschreibt. Die Validierung des Modells erfolgt durch Zellspray-Experimente, die einem zweistufigen Ansatz folgen. Zunächst werden die Tröpfchengröße und die Aufprallgeschwindigkeit gemessen und wie beschrieben zur Erstellung von Modellvorhersagen verwendet. Anschließend wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Sprühen als Funktion des Luftdrucks, der Flüssigkeitsviskosität, des Düsen-Substrat-Abstands und der Substratsteifigkeit gemessen. Es wird gezeigt, dass das Modell die Lebensfähigkeitsmessungen als Funktion der Eingabeparameter genau beschreibt. Diese Ergebnisse stellen ein leistungsstarkes Instrument zur rationalen Bewertung und Verbesserung klinischer Sprühbehandlungen und Tissue-Engineering-Anwendungen dar.

Beim Zellsprühen ist mit einer Zellschädigung vor allem beim Auftreffen der zellhaltigen Tröpfchen zu rechnen (siehe ergänzender Abschnitt I). Insbesondere führt ein Aufprall im Allgemeinen zu einer Zellverformung und einer Verlängerung der Zellmembran25, wie in Abb. 1(c,d) dargestellt. Bei einer Vergrößerung der Zellmembranfläche um bis zu ~5 % wird die Membran gedehnt, bleibt aber intakt. Bei größeren Ausdehnungen kann jedoch ein Bruch beobachtet werden26. Da ein Bruch im Allgemeinen zum Zelltod führt, wird die Überlebenswahrscheinlichkeit η gemäß Lit. als Funktion der relativen Zellmembranfläche γ (im Vergleich zum ungestörten Fall) modelliert. 27:

Überblick über die experimentelle Methode und Parameterdefinition.

Zur Erzeugung des Sprays wird eine Zweiphasen-Sprühdüse verwendet, die im Abstand h von der Oberfläche platziert wird. Die zellhaltige Flüssigkeit (mit der Viskosität μ) wird mithilfe einer Spritzenpumpe (nicht dargestellt) zur Düse gefördert. Am Düsengaseinlass wird Luft mit kontrolliertem Druck P zugeführt. Das Prallsubstrat wird mithilfe eines Linearmotors unter dem Spray bewegt (angedeutet durch horizontale Pfeile), wodurch ein sauberer und homogener Aufprall gewährleistet wird. Im Allgemeinen wird ein sauberes Glassubstrat verwendet, es werden jedoch Gelatine-Wasser-Mischungen (mit Gelatine-Gewichtsanteilen Cg) verwendet, um den Einfluss der Oberflächensteifigkeit zu beurteilen. (b) Querschnitt der Düse, der die Luft- und Flüssigkeitsströme und das verwendete Koordinatensystem veranschaulicht. Die Abbildungen (c) und (d) veranschaulichen Schlüsselvariablen, die die zellhaltigen Tröpfchen in der Luft (c) und während des Aufpralls (d) beschreiben.

mit γcr = 1,5 die kritische Membranausdehnung, wie in Lit. quantitativ angegeben. 27 und 2Δγ = 1 der Bereich der Oberflächenausdehnung, in dem die Zellen teilweise überleben. Zu den wichtigsten Modellbedingungen gehören eine elastische Zellreaktion auf Spannungen (die für Scherraten s−126 erfüllt ist; für die Schätzung der Scherspannung siehe ergänzenden Abschnitt I) und eine vernachlässigbare Wiederauffüllung der Lipidmembran während der Verformung (erfüllt für s−128). in der aktuellen Arbeit kennengelernt.

Um die relative Zellmembranfläche γ zu erhalten, wird zunächst ein „sauberer“ Zellaufprall auf einem harten Substrat betrachtet. Die Zelle wird als kugelförmiger Flüssigkeitströpfchen mit Durchmesser Dc, Geschwindigkeit Vc, Viskosität μc = 12 mPa·s, Dichte ρc = 1015 kg/m3 und Oberflächenspannung σc = 0,072 N/m2 beschrieben (wichtige Parameter sind in Abb. 1(c) dargestellt ,D)). Der beim Aufprall erreichte maximale Ausbreitungsdurchmesser Dc,max,0 wird dann als Funktion der Zell-Weber-Zahl berechnet, die das Verhältnis zwischen kinetischer Energie und Oberflächenenergie beschreibt29,30,31:

mit Zell-Weber-Zahl Diese Gleichungen gelten für Newtonsche Flüssigkeiten und für 29 (was für unsere Experimente erfüllt ist), wobei die Zell-Reynolds-Zahl Rec = ρcVcDc/μc das Verhältnis zwischen Trägheit und Viskosität darstellt. Die Zellform wird durch die Annahme einer Zellverformung zu einem abgeflachten Sphäroid und der Volumenerhaltung definiert. Zum Zeitpunkt des Erreichens seiner maximalen Ausdehnung beträgt seine Höhe . Dies ergibt die Verformung M0 für eine aufprallende Zelle, die gemäß Lit. definiert ist. 25:

Dh M0 = 0 für eine Kugel und M0 = 1 für eine Ebene.

Der potenziell große Einfluss des umgebenden Tröpfchens auf die Verformung der Zelle wurde von Tasoglu et al.25 numerisch modelliert. Die Neuinterpretation ihrer Ergebnisse liefert einen quantitativen Ausdruck, der die Zellverformung M als Funktion von M0, dem Durchmesser D0 des umgebenden Tröpfchens und seiner Viskosität μ0 erfasst (Einzelheiten siehe ergänzender Abschnitt III, zur viskositätsdominierten Verformung von Verbindungstropfen siehe Lit. 32). :

mit C0 einem Anpassungsparameter (der auf C0 = 5 gesetzt ist, wie im ergänzenden Abschnitt III besprochen). Anschließend wird M in den maximalen Ausbreitungsdurchmesser der (abgeplatteten-sphäroiden) Zelle übersetzt, der im Folgenden zur Berechnung der Zelloberfläche verwendet wird. Da dies gelegentlich dazu führt, dass der Zelldurchmesser den Tropfendurchmesser überschreitet, implementieren wir zusätzlich die Bedingung Dc,max = min(Dc,max,0, Dmax). Die Oberfläche A eines abgeflachten Sphäroids (die angenommene Form einer einzelnen trypsinisierten Zelle) kann wie folgt berechnet werden:

mit . Die relative Oberfläche ist gegeben durch , was das System vervollständigt.

Abschließend wird das Modell erweitert, um die Steifigkeit des Aufprallsubstrats zu berücksichtigen. Wir gehen davon aus, dass der Aufprall auf ein Flüssigkeitsbecken (mit Materialeigenschaften, die denen des Tropfens entsprechen) eine weiche Oberflächengrenze darstellt. Der Aufprall eines Tropfens mit dem Durchmesser D0 und der Geschwindigkeit V0 auf ein solches Becken wird (in erster Näherung) durch den Aufprall eines Tropfens mit dem Durchmesser 2D0 und der Geschwindigkeit 0,5 V0 auf ein hartes Substrat beschrieben33. Da der Aufprall von Tröpfchen auf weichen Oberflächen selbst für grundlegende Modellsysteme34 nicht ausreichend verstanden ist, schlagen wir einen effektiven Tröpfchendurchmesser und eine effektive Tröpfchengeschwindigkeit vor wie folgt:

wobei S ein beliebiger Steifigkeitsparameter ist, der von S = 0 für flüssige Oberflächen bis S = 1 für harte Oberflächen reicht. Eine Gelatine-Wasser-Mischung wird verwendet, um einen Substratsteifigkeitsbereich zu erzeugen, der einer Vielzahl natürlicher Gewebe entspricht35,36. Im hohen Scherbereich, der mit dem schnellen Aufprall von Mikrotröpfchen einhergeht, können die viskoelastischen Eigenschaften dieser Substrate mit keinem Standardviskosimeter gemessen werden. Daher wird der Gelatine-Massenanteil Cg zur Definition der Steifigkeit verwendet: S = C1Cg, wobei C1 eine Anpassungskonstante ist. Die Verwendung von C1 = 5 sorgt für eine angemessene Übereinstimmung zwischen dem Modell und unseren Messungen des Aufpralls auf weiche Oberflächen. Für Cg > 1/C1 definieren wir S = 1, was eine effektiv steife Oberfläche für Cg > 0,2 impliziert.

Abbildung 2 zeigt beispielhafte Modellergebnisse. Die Lebensfähigkeitswahrscheinlichkeit einzelner Zellen wird als Funktion der Aufprallgeschwindigkeit für unterschiedliche Größen des umgebenden Tröpfchens (Abb. 2 (a)) und unterschiedliche relative Viskositäten (Abb. 2 (b)) dargestellt. Bei niedrigen Geschwindigkeiten hängt die Lebensfähigkeit der Zellen nur schwach von den Aufprallparametern ab, da für niedrige Weber-Zahlen (We < 5) eine kleine und konstante Zellverformung angenommen wird. Bei steigenden Geschwindigkeiten (entsprechend We > 5) wird eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet. In diesem Regime haben die Größe des umgebenden Tröpfchens und seine Viskosität einen starken Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Größere umgebende Tröpfchen sorgen für eine stärkere Dämpfung und erhöhen dadurch die Lebensfähigkeit (Abb. 2(a)). Eine Erhöhung der Tröpfchenviskosität wirkt sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zelle aus, da bei μc = μ0 das Tröpfchen um die (relativ steife) Zelle herumfließt, wohingegen bei μc < μ0 die Zelle fließt, um den Aufprall des (relativ steifen) Tröpfchens zu dämpfen, was zu einer erheblichen Zellverformung führt und verminderte Lebensfähigkeit. Schließlich sorgen weichere Substrate für eine bessere Dämpfung, wie der Farbverlauf in Abb. 2(a) zeigt. Dabei verformt sich die Oberfläche so, dass die Verformung des Tropfens verringert wird. Dadurch wird die Zellverformung unterdrückt und eine höhere Lebensfähigkeit erwartet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine optimale Zelllebensfähigkeit für langsame, große und niedrigviskose zellhaltige Tröpfchen erwartet wird, die auf eine weiche Oberfläche auftreffen.

Modellvorhersagen der Zellüberlebenswahrscheinlichkeit η nach dem Aufprall als Funktion der Aufprallgeschwindigkeit V0 für ein Tröpfchen, das eine einzelne Zelle enthält.

Abbildung (a) zeigt den Einfluss des Tropfendurchmessers D0 (angezeigt durch Linien, die 1 ≤ D0/Dc ≤ 3 in Schritten von 0,5 darstellen) und der Oberflächensteifigkeit (angezeigt durch den Farbverlauf, der S = 1 (steifes Substrat) bis S = darstellt 0 (Flüssigkeitspool)). Abbildung (b) zeigt den Einfluss der Tropfenviskosität (Linienplotter für μ0 = 1, 2, 4, 8, 12 mPa s). Die durchgezogenen schwarzen Linien geben die Lebensfähigkeitswerte an, die für die Referenzparameter erhalten wurden: D0/Dc = 3, μc/μ0 = 10 und S = 1. Region (i) (schattiert) zeigt das Regime mit niedriger Weber-Zahl (We < 5). Hier ist die Zellverformung gering und unabhängig von der Aufprallgeschwindigkeit. Im Bereich (ii) wird aufgrund der zunehmenden Zellverformung eine abnehmende Lebensfähigkeit bei steigenden Geschwindigkeiten erreicht.

Um aus dem Modell Vorhersagen zur Zelllebensfähigkeit zu erhalten, sind die Tröpfchengröße und -geschwindigkeit erforderlich. Wir erhalten diese Parameter gemäß Abb. 3. Zunächst werden die Tröpfchen wie in Abb. 3 (a, b) dargestellt visualisiert. Die automatisierte Bildanalyse liefert dann den Tropfendurchmesser D0 und die Geschwindigkeit V0 = Δh/Δt, wie in Abb. 3(c,d) dargestellt. Bei jedem Sprühexperiment wird ein großer Bereich an Tröpfchengrößen und -geschwindigkeiten beobachtet. Eine repräsentative Stichprobe von Tröpfchengrößen und -geschwindigkeiten wird durch die schwarzen Markierungen in Abb. 3(e) angezeigt, die auch indikative Konturen der Zelllebensfähigkeit enthält (ähnliche Diagramme für verschiedene Sprühparameter sind im ergänzenden Abschnitt II enthalten). Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu ermitteln, wurde für jeden Tropfen die Zellüberlebenswahrscheinlichkeit als Funktion der Größe, Geschwindigkeit, Viskosität und Oberflächensteifigkeit berechnet. Dies liefert eine Verteilung der Zelllebensfähigkeitswahrscheinlichkeiten, wie in Abb. 3(f) dargestellt (entsprechend den Tropfengrößen- und Geschwindigkeitsverteilungen), deren Durchschnitt einen einzelnen vorhergesagten Zelllebensfähigkeitswert liefert, der im folgenden Abschnitt mit experimentellen Lebensfähigkeitsdaten verglichen wird .

Charakterisierung des Sprays.

Ein Beispielbildpaar wird vor ((a) und (b)) und nach der Bildverarbeitung ((c) und (d)) gezeigt. Wie durch die Kreise in (c) und (d) angedeutet, werden zwei Tröpfchen automatisch mithilfe einer selbst geschriebenen Bildanalysesoftware erkannt, die ihren Durchmesser D0 und ihre Translation Δh angibt. Abbildung (e) zeigt die Tröpfchengröße und -geschwindigkeit für P = 0,4 .105 Pa, μ = 1 mPa s, h = 3 cm. Die Markierungen (◻) zeigen 100 statistisch repräsentative Tröpfchen, aus denen das Spray besteht. Die Konturen stellen vorhergesagte Zelllebensfähigkeitswerte (η) dar. Abbildung (f) zeigt die relative Inzidenz f jeder Zellüberlebenswahrscheinlichkeit η, die der Übersichtlichkeit halber unterteilt ist. Die Mittelung dieser Wahrscheinlichkeitswerte ergibt die erwartete Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Sprühen (gestrichelte Linie). Die erwartete Lebensfähigkeit der Zellen hängt stark von der Einstellung der Sprühparameter ab, wie in Abb. 5 (rote Raute) dargestellt.

Um die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aufprall zu messen, werden Sprühexperimente mit dem in Abb. 1 dargestellten Aufbau durchgeführt. Nach dem Sprühen werden die Zellen gesammelt und in einem Lebend-Tot-Assay gefärbt, wofür ein Beispiel in Abb. 4 dargestellt ist. Unter Verwendung automatisierter Verfahren Durch Bildanalyse wird für jede Messung die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt. Abbildung 5 zeigt die gemessene Zelllebensfähigkeit als Funktion des Drucks, des Düsen-Substrat-Abstands, der Viskosität und der Oberflächensteifigkeit. Die Zelllebensfähigkeit wird auch als Funktion der Zeit nach dem Sprühen gemessen (siehe ergänzender Abschnitt V), was die langfristige Lebensfähigkeit der überlebenden Zellen zeigt.

Beispiel für einen Lebend-Tot-Assay.

Abbildung (a) zeigt das Originalbild; Abbildung (b) zeigt die Calcein-Färbung (in Grün) und Abbildung (c) zeigt die EthD-Färbung (in Rot). Die Kreise in den Abbildungen (b) und (c) geben die automatisch erkannten Zellen für jede Färbung an. Die Pfeile zeigen eine Zelle, in der beide Färbungen abgerufen werden. Diese Zellen gelten als beschädigt, aber lebensfähig und werden daher als lebend gezählt.

Zelllebensfähigkeit η als Funktion der Sprühkontrollparameter.

Die Abbildungen (a–d) zeigen die Lebensfähigkeit als Funktion des Drucks P, des Abstands zwischen Düse und Substrat h, der Flüssigkeitsviskosität μ bzw. des Gelatineanteils des Substrats. Die gemessenen Werte werden als blaue Quadrate angezeigt, wobei der Fehlerbalken die Standardabweichung darstellt. Rote Rauten zeigen Modellvorhersagen an. Die Linien dienen dem Auge als Orientierungshilfe für die Modellvorhersagen (die nicht als glatte Kurven dargestellt werden können, da sie von den Sprühverteilungen abhängen, wie im ergänzenden Abschnitt II erläutert). Die Referenzeinstellungen sind P = 0,4 .105 Pa, μ = 1 mPa s, h = 3 cm und ein Glasschlagsubstrat, wie durch den gelben Farbton in jedem Diagramm angezeigt.

Das Modell wird in Abb. 5 mit Zelllebensfähigkeitsmessungen verglichen. Es wird eine gute Übereinstimmung für den Druck, den Abstand zwischen Düse und Substrat und die Oberflächensteifigkeit beobachtet. Insbesondere werden die gemessenen Daten mit Ausnahme der unteren und oberen Druckdatenpunkte durch das Modell quantitativ beschrieben, was angesichts des einzigen verwendeten Anpassungsparameters bemerkenswert ist. Unser Modell überschätzt den Einfluss einer erhöhten Viskosität, erfasst aber dennoch den Trend. Der Grund für die geringere Lebensfähigkeit der Zellen bei zunehmendem Druck (4(a)) liegt darin, dass der Sprühnebel aus kleineren Tropfen besteht, die mit zunehmender Geschwindigkeit auftreffen, wie in Abb. 6 dargestellt. Beide Faktoren führen zu einer stärkeren Zellverformung und damit zum Zelltod. Eine Vergrößerung des Düsen-Substrat-Abstands verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen, wie in Abb. 5 (b) dargestellt. Abbildung 6 zeigt, dass dieser Trend hauptsächlich durch die abnehmende Tröpfchengeschwindigkeit weit entfernt von der Düse verursacht wird, was zu einer geringeren Verformung der Zelle und einer erhöhten Lebensfähigkeit führt. Höhere Viskositäten führen zu einer geringeren Lebensfähigkeit der Zellen, wie in Abb. 5(c) dargestellt. Bei hoher Viskosität erfolgt die Verformung des zellhaltigen Tröpfchens hauptsächlich innerhalb der Zelle. Dadurch wird die Zellmembran deutlich gedehnt und die Lebensfähigkeit nimmt ab. Schließlich verbessert die Verringerung der Oberflächensteifigkeit die Lebensfähigkeit (Abb. 5 (d)), da die sich verformende Oberfläche das auftreffende zellhaltige Tröpfchen „abfedert“.

Lebensfähigkeit als Funktion der Tröpfchengröße und -geschwindigkeit. Die Linie stellt die 50 %-Lebensfähigkeitskontur dar; Weitere Konturen sind in Abb. 3 (e) dargestellt. Die Punkte geben den mittleren Durchmesser gegenüber der mittleren Geschwindigkeit als Funktion des Sprühdrucks an (der Pfeil zeigt den zunehmenden Druck für P = [0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1].105 Pa an). Die leeren Quadrate geben den Abstand von der Düse für h = [30, 50, 100, 150] mm an. Mit zunehmendem Druck nimmt die Tröpfchengröße ab und die Aufprallgeschwindigkeit nimmt zu, was zu einer geringeren Lebensfähigkeit führt. Mit zunehmendem Abstand von der Düse nimmt die Aufprallgeschwindigkeit ab, was zu einer verbesserten Lebensfähigkeit führt. Der Einfluss der Viskosität und der Oberflächensteifigkeit ist in Abb. 2 dargestellt, da diese Größen keinen Einfluss auf die Tropfengröße und -geschwindigkeit haben.

Die Modellannahmen wirken sich auf seine Anwendbarkeit aus und verdienen daher eine weitere Diskussion. Erstens gilt die Annahme, dass die Zellen im Tröpfchen zentriert sind, ungefähr für Tropfengrößen, die knapp über der Zellgröße liegen. Bei größeren Tröpfchen können sich die Zellen jedoch am Rand des Ausbreitungsfilms befinden, wo die Scherspannungen viel höher sind als in das Zentrum31. Daher kann bei größeren Tropfen, wie sie bei niedrigen Drücken erzeugt werden (siehe ergänzende Abbildung 4 (a)), die Lebensfähigkeit der Zellen unterdrückt werden. Dieser Mechanismus erklärt möglicherweise die in Abb. 5(a) beobachtete geringere Lebensfähigkeit für P = 0,2·105 Pa. Zweitens, folgende Ref. 25 gehen wir davon aus, dass die Zellviskosität unabhängig von der Scherspannung ist. Da Experimente ein scherverdünnendes Verhalten von Zellen zeigen37,38, könnte die Implementierung der Scherverdünnung das Modell weiter verbessern. Drittens ist der Einfluss des Tropfenvolumens auf die Anzahl der Zellen pro Tropfen noch nicht berücksichtigt. Schließlich könnte sich der Einfluss der Viskosität auf die Zellverformung von Gleichung (7) unterscheiden, da Gleichung (7) aus numerischen Ergebnissen für viel größere zellhaltige Tröpfchen abgeleitet wird (Lit. 25, siehe auch ergänzenden Abschnitt III), während die meisten unserer Tröpfchen haben eine Größe, die knapp über der Zellgröße liegt (ergänzende Abbildung 3). Die Vermeidung dieser Annahmen durch Erweiterung des Modells kann zu einer noch besseren Übereinstimmung führen. Dennoch ist die Übereinstimmung zwischen unserem Modell und den Messungen bemerkenswert und liefert Beweise für die korrekte Erfassung der zugrunde liegenden Physik.

Durch Tröpfcheneinwirkung verursachte Zellschäden haben weitreichende Folgen für Anwender und Entwickler von Zellsprüh- und anderen Bioprinting-Technologien. In der klinischen Praxis ist der Bedarf an angemessenen Zellsprühprotokollen39 noch dringender als erwartet. Insbesondere die manuelle Bedienung von Sprühgeräten ist gängige Praxis, jedoch mit Schwankungen im Düsen-Substrat-Abstand, im Luftdruck und in der Viskosität verbunden. Diese Variablen sollten sorgfältig kontrolliert werden, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen sicherzustellen. Die tatsächlichen Werte können immer noch von der Düsenkonstruktion und dem Zelltyp abhängen, aber eine Vergrößerung des Sprühabstands und die Verwendung niedrigviskoser Sprühsuspensionen bei gleichzeitiger Vermeidung harter Aufprallflächen verbessern im Allgemeinen das Überleben der Zellen.

Allerdings können schädliche Sprühbedingungen aufgrund behandlungsspezifischer klinischer Anforderungen oder Einschränkungen bei der Biofabrikation nicht immer vermieden werden. Beispielsweise ist bei arthroskopischen Eingriffen der Abstand zwischen Düse und Oberfläche auf höchstens 1 cm4 begrenzt. Aufgrund unserer Ergebnisse ist unklar, ob der Behandlungserfolg bei Verbrennungsbehandlungen, bei denen dieser Abstand in der Regel mehr als 10 cm beträgt, bei arthroskopischer Anwendung reproduziert werden kann (siehe Abb. 5(b)). Zudem stellt die Aufprallfläche bei vielen Behandlungen einen Gewebedefekt dar und kann daher nicht frei gewählt oder verändert werden. Unsere härtesten gelatinehaltigen Oberflächen führen zu einer ähnlich geringen Lebensfähigkeit wie Hartglasoberflächen. Diese 20 % Gelatineoberflächen ähneln in ihrer Steifheit dem Muskelgewebe35, das zu den weicheren menschlichen Geweben zählt36. Daher sind klinisch relevante Oberflächen relativ steif, was möglicherweise das Überleben der Zellen beeinträchtigt. Um dieses Problem zu lösen, müssen die Sprühparameter optimiert werden. In ähnlicher Weise ist normalerweise die Ablagerung von viskosen, zellhaltigen Hydrogelen erforderlich, um die gewünschte 3D-Gewebearchitektur bei der Biofabrikation zu bewahren12. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass solche Flüssigkeiten die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen (siehe Abb. 5(c)). Eine Verringerung des Sprühdrucks2,15,16,17, die Verwendung weicherer Aufprallflächen24 oder eine Vergrößerung des Düsen-Substrat-Abstands können dem negativen Einfluss der erhöhten Viskosität entgegenwirken (siehe Abb. 5), aber leider sind diese Parameter manchmal auch eingeschränkt.

Das größte Potenzial zur Verbesserung der Zelllebensfähigkeit beim Zellsprühen scheint daher in der Optimierung des Sprühdüsendesigns zu liegen. Insbesondere eine Designoptimierung, die zu größeren und monodispersen Tröpfchengrößen und verringerten Aufprallgeschwindigkeiten führt, würde eine erfolgreiche Zellabscheidung in einem erweiterten Viskositätsbereich ermöglichen. In dieser Studie haben wir das Duploject-System verwendet, das für die klinische Anwendung von Fibrinkleber durch Sprühen zugelassen ist und auch zum Sprühen von Zellen verwendet wird4. Der von dieser Düse erzeugte Sprühnebel zeichnet sich durch hochpolydisperse Tropfendurchmesser und -geschwindigkeiten aus. Selbst bei den sanftesten Sprühparametern treten Stöße mit hoher Geschwindigkeit auf, wodurch die gemessene höchste Zelllebensfähigkeit nach dem Sprühen auf 90 % begrenzt wird. Düsendesigns, die mehr monodisperse Tröpfchen erzeugen, können diese tödlichen Ereignisse verhindern, selbst beim Versprühen viskoser Flüssigkeiten mit hohem Durchsatz. Mit unserem Versuchsaufbau können solche zukünftigen Sprühdüsen rational optimiert werden, was das Anwendungsfenster des Zellsprühens erheblich erweitern kann.

Schließlich könnten auch andere tröpfchenbasierte Zellabscheidungstechnologien von unserem Ansatz profitieren. Beim Tintenstrahl-Biodruck werden hochmonodisperse zellhaltige Tröpfchen40,41,42,43 abgeschieden. Typischerweise treffen hier niedrigviskose Tröpfchen von 40 m (die die Zellgröße um den Faktor 3 überschreiten) mit Geschwindigkeiten unter 10 ms−1 auf. In diesem Bereich wird im Allgemeinen eine gute Lebensfähigkeit gemessen23, was mit unserem Modell übereinstimmt (Abb. 2). Allerdings wird bei Nervenzellen eine verminderte Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet44. Unsere Studie legt nahe, dass insbesondere eine Verringerung der Flüssigkeitsviskosität oder eine Verringerung der Tröpfchenausstoßgeschwindigkeit die Lebensfähigkeit der Zellen dieser fragileren Zelltypen verbessern könnte. Diese Maßnahmen reduzieren die zu erwartende Zellschädigung sowohl in der Düse als auch beim Aufprall, die beide wahrscheinliche Ursachen für Zellschäden beim Tintenstrahldruck sind (siehe ergänzender Abschnitt 1). Durch die Verwendung weicher Aufprallsubstrate oder größerer Düsen-Substrat-Abstände werden stoßbedingte Schäden immer noch reduziert, düsenbedingte Zellschäden oder Poration10 können auf diese Weise jedoch nicht unterdrückt werden.

Auch die beim laserunterstützten Bioprinting (LAB) beobachteten Zelllebensfähigkeitstrends werden durch unser Modell beschrieben. Hierbei wird ein gepulster Laser auf einen zellhaltigen Flüssigkeitsfilm fokussiert, was zur Verformung dieses Films und zum Aufbrechen in zellhaltige Tröpfchen führt45,46. Durch Platzieren eines Empfängersubstrats in der Fluglinie des zellhaltigen Tröpfchens wird die Abscheidung erreicht. Erhöhte Aufprallgeschwindigkeiten führen zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen47,48 und weiche Aufpralloberflächen verbessern das Überleben der Zellen49, analog zu unseren in Abb. 2 gezeigten Modellergebnissen. Überraschenderweise wurde eine verbesserte Lebensfähigkeit der Zellen bei erhöhter Viskosität berichtet48, dies wurde jedoch durch die verringerte Aufprallgeschwindigkeit erklärt zur erhöhten Viskosität. Es wäre daher äußerst interessant, die Lebensfähigkeit der Zellen als Funktion der Flüssigkeitsviskosität bei kontrollierter Aufprallgeschwindigkeit zu untersuchen. Solche Experimente können auch das Verständnis der Zellmembranverformung aufgrund gepulster Scherspannungen50 voranbringen, wie sie beim Aufprall zellhaltiger Tröpfchen auftreten.

Abschließend präsentieren und validieren wir ein analytisches Modell, das die Zelllebensfähigkeit als Funktion der Tröpfchenaufprallparameter beschreibt. Das Modell beschreibt Zelllebensfähigkeitstrends beim Zellsprühen, beim Inkjet-Bioprinting und beim lasergestützten Zelltransfer und bestätigt die allgemeine Bedeutung des Tröpfcheneinschlags für das Zellüberleben beim Bioprinting. Da künftige Biofabrikationsanwendungen die Ablagerung verschiedener, möglicherweise fragilerer Zelltypen, die in hochviskosen Biotinten enthalten sind, mit hohem Durchsatz beinhalten könnten, gehen wir davon aus, dass die Vermeidung von Zellschäden noch wichtiger werden wird. Insbesondere wird das Überleben der Zellen nach dem Sprühen vom Zelltyp abhängig sein. Darüber hinaus erfordern verschiedene Biotinten möglicherweise unterschiedliche Abscheidungsparameter in Kombination mit speziellen Düsendesigns, die einen monodispersen Tröpfchenausstoß ermöglichen und gleichzeitig niedrige Scherraten innerhalb der Düse aufrechterhalten. Unsere Studie bietet einen Rahmen zur Optimierung des Zellüberlebens in solchen zukünftigen Anwendungen und trägt zur zuverlässigen Biofabrikation komplexer 3D-Gewebekonstrukte klinisch relevanter Größe bei.

Dermale Fibroblasten von neugeborenen Ratten (ITK Diagnostics) wurden in Minimum Essential Medium α (α-MEM) (Gibco) kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) (Lonza), 1 % L-Glutamin (Gibco) und 1 % Pen/ Strep (Gibco) bei 37 °C und 5 % CO2.

Die Zellen wurden bei 80 % Konfluenz durch Trypsinisierung geerntet und für Impact-Experimente mit 1,5 × 106 Zellen pro ml in Kulturmedium ohne FBS suspendiert. Optional wurde den Zellsuspensionen Dextran (Sigma, 15–25 kDa) zugesetzt, um die Viskosität zu erhöhen. Der Einfluss der Dextrankonzentration auf die Flüssigkeitsviskosität wurde mit einem Viskosimeter (Rheolab QC, Anton Paar) gemessen. Wie in der ergänzenden Abbildung 10 dargestellt, stimmt die gemessene Viskosität mit Literaturwerten überein.

Zellspray-Experimente wurden mit dem in Abb. 1 gezeigten Aufbau durchgeführt. Mit einer Spritzenpumpe wurde die Zellsuspension durch eine Sprühdüse (Duploject-Sprühsystem (Baxter AG)) gedrückt. Fotos dieses Systems, das auch als Bio bekannt ist -Airbrush, sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt) mit einer kontrollierten Flüssigkeitsdurchflussrate von 2,4 ml pro Minute. Die Aufprallfläche bestand aus einem sauberen Standardobjektträger, der mit einer PDMS-Maske bedeckt war, um einen definierten und reproduzierbaren Aufprallbereich zu gewährleisten. Diese Objektträger wurden optional mit einer Gelatineschicht (Typ A, Sigma, d = 0,5 mm) beschichtet, um die Oberflächensteifigkeit anzupassen. Ein entscheidender Aspekt des Experiments ist, dass der Aufprall auf einer trockenen Oberfläche erfolgt, das heißt, dass der Zellspray nicht auf zuvor versprühte Tröpfchen trifft. Um dies zu gewährleisten, wurde die Aufprallfläche mithilfe eines programmierbaren Linearmotors reproduzierbar bewegt. Die Substratgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass für jedes Experiment 12 ± 0,5 mg der versprühten Flüssigkeit gesammelt wurden (die Geschwindigkeit wurde mit zunehmendem Abstand zwischen Düse und Substrat verringert, da die Sprühdichte mit zunehmendem Abstand von der Düse abnimmt). Dieses Gewicht entspricht einem Flüssigkeitsfilm von 18 μm (was etwa einer Zelldicke entspricht) und führte dazu, dass etwa die Hälfte der Oberfläche mit versprühten Tröpfchen bedeckt war, sodass die meisten Tröpfchen auf der trockenen Oberfläche landeten. Innerhalb von 10 s nach jedem Sprühexperiment wurde die Oberfläche mit FBS-freiem Kulturmedium gespült, um die Zellen zu sammeln. Die aus drei verschiedenen Proben gespülten Zellen (mit gleichen Parametereinstellungen besprüht) wurden in einem 12-ml-Zentrifugenröhrchen (Greiner) gesammelt. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde anschließend in einem Lebend-Tot-Assay verarbeitet. Für jede Parametereinstellung wurden drei unabhängige Sprühzyklen durchgeführt (dh 9 Aufprallflächen wurden in drei verschiedenen Röhrchen gesammelt). Dieser Ansatz lieferte drei Datenpunkte für jede Parametereinstellung, die zur Anzeige des Fehlerbalkens in Abb. 5 verwendet wurden.

Die gesammelten Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 1 nM Calcein AM und 6 nM Ethidiumhomodimer, bei 37 °C und 5 % CO2 30 Minuten lang inkubiert. Jede gefärbte Zellsuspensionsprobe wurde in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen überführt und 8 zufällige Flecken pro Vertiefung wurden innerhalb von 2 Stunden nach jedem Sprühexperiment abgebildet (EVOS Fl-Mikroskop). Lebende (grün) und tote (rot) Zellen wurden mithilfe eines selbst geschriebenen Matlab-Skripts automatisch gezählt (Abb. 5 zeigt ein Beispiel), was zu einem Durchschnitt von 450 ± 332 (Standardabweichung) detektierten Zellen pro Probe führte (mit einem Minimum von 12). Zellen). Sowohl lebende als auch tote gefärbte Zellen galten als beschädigt, aber lebensfähig und wurden daher als lebendig gezählt. Für jede Probe wurde die Lebensfähigkeit entsprechend berechnet. Alle Messungen wurden anschließend korrigiert, indem die Lebensfähigkeit der Kontrolle (keine Auswirkung, gleichzeitig gemessen) auf 100 % gesetzt wurde.

Da das Überleben der Zellen entscheidend von den Eigenschaften der zellhaltigen Tröpfchen abhängt, wurden die Sprüheigenschaften im Detail bestimmt. Der verwendete Aufbau ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Alle sprüherzeugenden Komponenten entsprachen den Komponenten, die zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit verwendet wurden (Abb. 1). Zur Hellfeldbeleuchtung wurde ein Dual-Puls-ND:Yag-Laser mit einer Pulsdauer von 6 ns verwendet. Um Streifen zu vermeiden, wurde das kohärente Laserlicht mithilfe einer vor dem Laser platzierten Fluoreszenzplatte gestreut. Die nicht kohärenten Impulse wurden von einer Dual-Shutter-Kamera (Sensicam, PCO) erfasst. Die Zeitverzögerung zwischen den Beleuchtungsimpulsen wurde auf 1 μs eingestellt, was ausreichend lang ist, um die Translation Δh der Tröpfchen zu messen und gleichzeitig eine Verwechslung zwischen verschiedenen Tröpfchen zu verhindern. Alle Zeitpunkte wurden mit einem BNC 575-Impulsverzögerungsgenerator (nicht gezeigt) gesteuert. Es wurde ein 10-fach-Fernobjektiv verwendet, was zu einem Sichtfeld von 0,67 × 0,89 mm2 führte. Da die Brennebenendicke dieses Objektivs δF ≈ 0,1 ± 0,03 mm beträgt, wurde ein Volumen von 0,67 × 0,89 × 0,1 mm3 visualisiert. Da der Spray viel größer als dieses Volumen ist, wurden Messungen an verschiedenen z- und h-Positionen durchgeführt, um den Spray vollständig zu charakterisieren, wie durch die kleinen Rechtecke in der ergänzenden Abbildung 1(b) dargestellt (die r-Position wird an der Düse beibehalten). Achse).

Für jede Messung wurden 400 Bildpaare erhalten. Beispielbilder sind in Abb. 3(a,b) dargestellt, wo die Abwärtsbewegung der Tröpfchen deutlich sichtbar ist. Bewegungsunschärfe wurde durch die kurzen Beleuchtungsimpulse von 6 ns verhindert. Die Tröpfchen wurden mithilfe eines selbst geschriebenen Matlab-Skripts automatisch erkannt. Es wurden automatisch ausreichend scharf erscheinende Tröpfchen ausgewählt, wie durch die roten Kreise in Abb. 3 (c, d) dargestellt. Hier war der Tropfen oben links zu unscharf, um erkannt zu werden, und wurde verworfen. Obwohl die Tröpfchen in Abb. 3 eine ähnliche Größe haben, ermöglichte die Bildverarbeitungssoftware die erfolgreiche Erkennung von Tröpfchen im Bereich von 1 ≤ D0 ≤ 100 μm.

Objektträger aus Glas wurden optional mit einer Gelatineschicht (Typ A, Sigma) mit einer Dicke von 0,5 mm beschichtet und vor dem Experiment 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft gehalten. Die Oberflächensteifigkeit wurde durch Zugabe von Gelatine-Massenanteilen von Cg = [2, 5, 10, 20] % zu PBS eingestellt. Im Soft-Surface-Limit wurde PBS ohne Gelatine verwendet.

Zitierweise für diesen Artikel: Hendriks, J. et al. Optimierung der Zelllebensfähigkeit bei der tröpfchenbasierten Zellablagerung. Wissenschaft. Rep. 5, 11304; doi: 10.1038/srep11304 (2015).

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Für die finanzielle Unterstützung durch die Foundation for Fundamental Research of Matter (FOM) danken CWV, DL und CS. MK und JH werden von der Dutch Arthritis Association unterstützt.

Hendriks Jan und Willem Visser Claas haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Entwicklungsbiotechnik, MIRA-Institut für biomedizinische Technologie und technische Medizin, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, Universität Twente, Niederlande

Jan Hendriks, Sieger Henke, Jeroen Leijten und Marcel Karperien

Physics of Fluids Group, MIRA-Institut für biomedizinische Technologie und technische Medizin, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, JM Burgers Center for Fluid Dynamics, Universität Twente, Niederlande

Claas Willem Visser, Chao Sun & Detlef Lohse

Abteilung für Orthopädie, UMC Utrecht, Niederlande

Daniel BF Saris

Abteilung für Rekonstruktive Medizin, MIRA-Institut für biomedizinische Technologie und technische Medizin, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, Universität Twente, Niederlande

Daniel BF Saris

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MK, DL, CWV und JH haben die Forschung entworfen; JH und SH stellten die Zellproben zur Verfügung; JH und CWV führten die Messungen durch; CWV und JH haben das Modell entworfen; JH, CWV, CS und DL steuerten Analysetools bei; JH, CS, MK und CWV analysierten die Daten; DS und JL lieferten wertvolle Beiträge zur Dateninterpretation; CS, DL und MK überwachten die Arbeiten; CWV, JH und MK haben den ersten Entwurf des Artikels geschrieben; Alle Autoren diskutierten das Werk.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Hendriks, J., Willem Visser, C., Henke, S. et al. Optimierung der Zelllebensfähigkeit bei der tröpfchenbasierten Zellablagerung. Sci Rep 5, 11304 (2015). https://doi.org/10.1038/srep11304

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Eingegangen: 08. Januar 2015

Angenommen: 24. April 2015

Veröffentlicht: 11. Juni 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep11304

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